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物种分类分析

MICOS-2024 物种分类与多样性分析完整指南。

目录

概述

物种分类模块识别并定量分析宏基因组样本中的微生物种类。它将质量控制、序列分类和多样性分析整合为一个完整的分析流程。

核心特性

  • 高速分类: Kraken2 处理速度约 1000 万 reads/分钟
  • 精确丰度估计: Bracken 改善种水平定量
  • 交互式可视化: Krona 图表探索分类组成
  • 多样性指标: 通过 QIIME2 计算 Alpha 和 Beta 多样性
  • 统计分析: 差异丰度检验

方法论

分类算法 (Kraken2)

Kraken2 使用 k-mer 进行分类：

  1. 数据库构建: 参考基因组被分解为 k-mers（默认 k=35）
  2. 最小化索引: 仅存储最小化子以减少内存使用
  3. 分类: 使用 LCA（最近公共祖先） 算法将输入 reads 与数据库匹配
  4. 置信度评分: 基于 k-mer 覆盖度计算分类置信度

丰度校正 (Bracken)

Bracken 校正以下偏差：

  • 基因组大小偏差: 较大基因组贡献更多 reads
  • 数据库覆盖度: 不完整的参考数据库
  • 菌株变异: 同一物种的多个菌株

分类层级

层级代码示例
域DBacteria
门PProteobacteria
纲CGammaproteobacteria
目OEnterobacterales
科FEnterobacteriaceae
属GEscherichia
种SEscherichia coli

工作流程

原始 FASTQ
    │
    ▼
质量控制 (KneadData)
    │
    ▼
物种分类 (Kraken2)
    │
    ├─► 丰度校正 (Bracken)
    │
    └─► Krona 可视化
         │
         ▼
    BIOM 格式转换
         │
         ▼
    多样性分析 (QIIME2)

输入要求

数据格式

格式扩展名配对/单端
FASTQ (gzip).fastq.gz配对或单端
FASTQ.fastq配对或单端

命名规范

双端测序:
  Sample1_R1.fastq.gz
  Sample1_R2.fastq.gz

单端测序:
  Sample1.fastq.gz

质量要求

指标最低值推荐值
读长≥ 50 bp≥ 100 bp
质量分数 (Q30)> 70%> 85%
每样本测序深度100 万 reads1000 万+ reads

运行分析

方式 1: 完整流程

python -m micos.cli full-run \
  --input-dir data/raw_input \
  --results-dir results \
  --threads 16 \
  --kneaddata-db /path/to/kneaddata_db \
  --kraken2-db /path/to/kraken2_db

方式 2: 仅物种分类

python -m micos.cli run taxonomic-profiling \
  --input-dir data/cleaned_reads \
  --output-dir results/taxonomy \
  --threads 16 \
  --kraken2-db /path/to/kraken2_db \
  --confidence 0.1

方式 3: 手动步骤

# 步骤 1: 运行 Kraken2
kraken2 --db /path/to/kraken2_db \
  --paired sample_R1.fastq sample_R2.fastq \
  --output sample.kraken \
  --report sample.report \
  --confidence 0.1 \
  --threads 16
 
# 步骤 2: 运行 Bracken
bracken -d /path/to/kraken2_db \
  -i sample.report \
  -o sample.bracken \
  -r 150 \
  -l S
 
# 步骤 3: 转换为 BIOM
kraken-biom *.report --fmt hdf5 -o feature-table.biom
 
# 步骤 4: 生成 Krona
ktImportTaxonomy -o sample.krona.html sample.report

参数配置

Kraken2 参数

taxonomic_profiling:
  kraken2:
    # 分类置信度 (0.0 - 1.0)
    # 越高越严格，分类的 reads 越少
    confidence: 0.1
    
    # k-mer 匹配的最低碱基质量
    min_base_quality: 20
    
    # 是否使用内存映射数据库（更快，更多内存）
    memory_mapping: true
    
    # 在输出中包含学名
    use_names: true

置信度阈值选择

值灵敏度精确度适用场景
0.0很高较低探索性分析
0.1高良好默认，平衡
0.3中等高保守分析
0.5低很高仅高置信度

输出文件

目录结构

results/taxonomic_profiling/
├── raw/
│   ├── sample1.kraken      # 原始分类输出
│   └── sample1.report      # 分类报告
├── bracken/
│   └── sample1.bracken     # 校正后丰度
├── krona/
│   └── sample1.krona.html  # 交互式可视化
└── biom/
    └── feature-table.biom  # QIIME2 兼容表格

Kraken2 报告格式

列描述示例
1reads 百分比56.32
2reads 数量 (分支)563200
3reads 数量 (直接)10000
4层级代码S
5NCBI TaxID562
6学名Escherichia coli

结果解读

分类率

分类率解读操作
< 50%高未分类率检查数据库覆盖度，考虑降低置信度
50-70%中等大多数分析可接受
70-90%良好标准性能
> 90%优秀高质量数据和良好数据库覆盖

多样性指标

Alpha 多样性 (样本内)

指标测量内容范围说明
Shannon多样性 (丰富度 + 均匀度)0 - ~7越高越多样
Chao1丰富度估计器0+对稀有类群敏感
Simpson均匀度0-1越低越均匀

人类肠道典型值:

  • Shannon: 2.5-4.5
  • 观察物种数: 50-200

高级主题

自定义数据库创建

# 构建自定义 Kraken2 数据库
kraken2-build --download-taxonomy --db custom_db
kraken2-build --add-to-library custom_genome.fa --db custom_db
kraken2-build --build --threads 16 --db custom_db

菌株水平分析

# 使用更高置信度阈值进行菌株分析
taxonomic_profiling:
  kraken2:
    confidence: 0.3
    use_names: true

故障排除

问题: 分类率低

症状: <50% reads 被分类

解决方案:

# 1. 降低置信度阈值
taxonomic_profiling:
  kraken2:
    confidence: 0.05
 
# 2. 使用更大的数据库
# 从 MiniKraken 切换到 Standard
 
# 3. 检查数据质量
# 对输入 reads 运行 FastQC

问题: 数据库加载慢

解决方案:

# 使用内存映射
taxonomic_profiling:
  kraken2:
    memory_mapping: true
 
# 或使用 SSD 存储数据库

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