FASTQ 格式：原始测序观测的标准化编码

快速概览

FASTQ 是生物信息学分析流程的起点，承载测序仪输出的原始 reads 及其质量分数。理解其结构、质量编码体系和变体，是质控、比对和定量分析的前提。

• FASTQ 四行结构：标识符、序列、分隔符、质量分数
• Phred 质量分数将 ASCII 字符映射为碱基错误概率
• 不同测序平台（Illumina、PacBio、ONT）的 FASTQ 变体与质量编码体系
• FASTQ 不保存任何参考坐标信息——比对后才建立位置关系

所属板块 数据、注释与资源

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是什么

FASTQ 格式编码的是原始测序观测（raw sequencing reads）——测序仪直接输出的碱基序列及其对应的质量分数（quality scores）。这是分析流程的起点，承载实验观测的原始证据。

每条测序 read 在 FASTQ 中由四行组成：

@SEQ_ID
GATTTGGGGTTCAAAGCAGTATCGATCAAATAGTAAATCCATTTGTTC
+
!''*((((***+))%%%++)(%%%%).1***-+*''))**55CCF>>>

行号	内容	说明
1	标识符行（@ 开头）	read ID、仪器信息、barcode/UMI（如有）
2	碱基序列	测序仪调用的碱基（A/C/G/T/N）
3	分隔符（+ 开头）	可重复标识符，或留空
4	质量分数	ASCII 编码的 Phred 质量值，与第 2 行等长

为什么重要

FASTQ 是整个分析链条的证据源头。所有下游分析——比对、变异检测、表达定量——的可靠性都取决于 FASTQ 中保存的原始观测质量。

理解 FASTQ 的关键在于认识到：

• 它只包含”读到了什么”，不包含”它在哪里”——位置信息需要比对后才能获得
• 质量分数是误差模型的核心——后续算法（如变异检测器）依赖质量值计算置信度
• 格式变体反映测序技术差异——Illumina 短读长与 PacBio/ONT 长读长的 FASTQ 有不同的特征

前置知识

• 测序 Reads、覆盖度与错误模型
• 了解 Phred 质量分数的定义：$Q = -10 \log_{10}(P)$，其中 $P$ 是碱基调用错误概率
• 参考基因组、坐标系统与注释

Phred 质量分数体系

数学定义

Phred 质量分数 $Q$ 与碱基错误概率 $P$ 的关系为：

$Q = -10 \log_{10}(P)$

反过来，错误概率为：

$P = 10^{-Q/10}$

常用质量值对照

Phred Q	错误概率 P	碱基正确率	说明
10	0.1	90%	低质量阈值
20	0.01	99%	常用质控阈值
30	0.001	99.9%	Illumina 高质量 reads
40	0.0001	99.99%	极高置信度

ASCII 编码

质量分数通过 ASCII 字符编码存储。历史上存在三种编码体系：

编码体系	ASCII 范围	Phred 范围	使用场景
Sanger / Phred+33	! (33) ~ ~ (126)	0 ~ 93	现代 Illumina（1.8+）、PacBio、ONT
Illumina 1.3+ / Phred+64	@ (64) ~ ~ (126)	0 ~ 62	旧版 Illumina（1.3-1.7）
Solexa	; (59) ~ ~ (126)	-5 ~ 62	极早期 Solexa 仪器

关键注意：现代测序数据几乎统一使用 Phred+33 编码。如果看到质量字符从 ! 开始，通常是 Phred+33；如果从 @ 开始，可能是 Phred+64。

质量值的生物学意义

质量分数不仅仅是技术指标，它直接影响下游分析：

• 低质量碱基可能导致错误的变异调用（false positive SNPs）
• 质量分布偏移可能指示测序周期末端的信号衰减
• 质量修剪（quality trimming） 是质控流程的标准步骤，去除低质量末端

FASTQ 标识符的结构

现代 FASTQ 标识符行包含丰富的元数据。以 Illumina 为例：

@M00123:45:000000000-A1B2C:1:1101:12345:6789 1:N:0:ATCACG

字段	说明
M00123:45	仪器 ID 和运行 ID
000000000-A1B2C	Flowcell ID
1:1101	流道（lane）和瓦片（tile）
12345:6789	簇的 x/y 坐标
1	read 编号（1 或 2，paired-end 时区分）
N	是否过滤（Y = 未通过，N = 通过）
0	控制位
ATCACG	index/barcode 序列

PacBio 和 Oxford Nanopore 的标识符格式不同，通常包含 molecule ID、zmw 坐标等信息。

Paired-end 与单端

单端测序（Single-end）

每个 DNA 片段产生一条 read，存储在一个 FASTQ 文件中。

双端测序（Paired-end）

每个 DNA 片段从两端分别测序，产生 read1 和 read2：

sample_R1.fastq.gz  ← read 1 序列
sample_R2.fastq.gz  ← read 2 序列

两个文件中的 reads 按顺序一一对应（第 n 行的 read1 与第 n 行的 read2 来自同一个 DNA 片段）。

关键约束：paired-end 分析要求两个 FASTQ 文件的 read 顺序严格同步。如果文件被打乱，配对关系将丢失。

FASTQ 与其他格式的关系

对比	FASTQ	对比格式
FASTA	包含序列 + 质量分数，是原始观测	只包含序列，常作为参考序列
SAM/BAM	尚未建立参考坐标关系	比对后获得位置、CIGAR、MAPQ
VCF	只包含原始 reads，无变异推断	基于比对证据的变异调用结果

核心原则：FASTQ 是分析流程的输入层，不保存任何比对、注释或变异信息。

与真实工具或流程的连接

与真实工具或流程的连接

• 质控工具：FastQC（质量报告）、MultiQC（汇总报告）、fastp（质控+修剪）
• 比对工具：BWA-MEM、Bowtie2、minimap2 以 FASTQ 为输入，输出 SAM/BAM
• 定量工具：Salmon、kallisto 支持直接从 FASTQ 进行 pseudo-alignment 定量
• 组装工具：SPAdes、MEGAHIT 使用 FASTQ 作为 de novo 组装输入

常见概念误区

常见误区

• **质量编码混淆**：假设所有 FASTQ 都使用 Phred+33，而旧版 Illumina 数据可能使用 Phred+64，导致质量值解读错误。
• **FASTQ 包含位置信息**：FASTQ 只保存 reads 本身，比对后才获得参考坐标。
• **paired-end 文件可独立处理**：R1 和 R2 必须配对使用，单独分析一端会丢失插入片段（insert size）信息。
• **质量值=碱基可靠性绝对指标**：质量分数是测序仪估计值，可能存在系统性偏差，需结合质控工具验证。
• **FASTQ 文件可以随意重排**：paired-end 的两个文件必须保持 read 顺序同步，否则配对关系丢失。

本章小结

• FASTQ 是分析流程的证据源头，保存原始 reads 和质量分数
• Phred 质量分数通过 ASCII 编码，现代数据统一使用 Phred+33
• FASTQ 不保存参考坐标——比对后才建立位置关系
• 质控和质量修剪是 FASTQ 进入下游分析前的标准步骤

相关页面

下游格式

SAM/BAM 格式

比对后 reads 获得参考坐标，保存在 SAM/BAM/CRAM 中。

延伸阅读

基础层

测序 reads 与 coverage

理解 reads 的生成机制、coverage 概念和质量模型。

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对比

FASTA 格式

FASTA 只包含序列，不带质量分数，常用于参考序列。

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NCBI SRA 数据下载

SRA 存储原始测序数据，通过 SRA Toolkit 转换为 FASTQ。

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DNA-seq 变异检测总览

FASTQ 质控后进入比对和变异检测流程。

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