RNA-seq 工作流概览

快速概览

这是一页把 RNA-seq 从原始 reads 一路串到定量、归一化、差异分析与功能解释的总览页面，重点是建立流程地图而不是记命令。

如果你刚开始接触 RNA-seq，先把流程中的输入输出、注释依赖和定量目标区分清楚。
如果你已经做过一些分析，这页更适合你回头定位每一步依赖的算法与统计前提。

所属板块 分析方向与案例

把基础对象与算法方法重新放回真实分析任务与工作流。

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是什么

RNA-seq 工作流描述的是：如何从转录组测序得到的 reads 出发，经过比对或 pseudo-alignment、表达定量、统计分析与功能解释，最终回答基因表达和转录调控相关问题。

它既是 NGS 工作流中的一个重要分支，也是很多生物学研究里最常见的分析路线之一。

为什么重要

RNA-seq 常用于回答：

哪些基因在样本中被表达；
表达量有多高；
不同条件之间是否存在差异表达；
是否存在新的剪接事件或转录本结构。

相比 DNA 测序，RNA-seq 的一个关键特点是：

它面对的是转录本而不是整个基因组；
同一个基因可能有多个 isoform；
结果很依赖注释和定量模型。

前置知识

核心概念

1. 质控与过滤

与一般 NGS 一样，RNA-seq 也要先检查：

read 质量是否稳定；
是否有接头污染；
是否存在样本间明显偏差；
文库复杂度是否足够。

但 RNA-seq 还需要特别警惕：

rRNA 污染；
3’ 偏好或覆盖不均；
批次效应。

2. 比对或 pseudo-alignment

RNA-seq 的核心选择之一是：

做传统 spliced alignment；
或做 pseudo-alignment / lightweight mapping。

前者更适合需要精确定位、剪接分析或新转录本研究的场景；后者在表达定量任务中通常更快。

这里隐含的算法问题包括：

如何处理跨外显子 reads；
如何在多个转录本之间分配 read；
如何使用索引结构快速定位候选位置。

3. 定量

定量的目标是估计：

基因层表达量；
转录本层表达量。

但定量并不是简单计数。困难在于：

一个 read 可能同时兼容多个 isoform；
长基因和短基因的计数不可直接比较；
总测序深度不同也会影响原始 counts。

因此，定量通常结合模型、有效长度和多重比对分配策略来完成。

4. 归一化

归一化是为了让不同样本之间的表达值可以更公平地比较。

常见动机包括：

测序深度不同；
文库组成差异；
某些高表达基因对整体分布产生偏移。

5. 差异分析

差异分析要回答的是：

某个基因在条件 A 和条件 B 下是否显著不同；
变化方向和幅度是什么；
统计显著性是否足够。

这里常涉及：

count model；
dispersion estimation；
multiple testing correction。

6. 功能解释

仅有差异表达基因列表通常还不够，我们还需要进一步做：

GO / pathway enrichment；
gene set interpretation；
与数据库和文献结果对照；
与实验背景结合解释。

示例

一个简化的 RNA-seq 分析链路可以写成：

FASTQ -> QC -> spliced alignment / pseudo-alignment -> quantification -> normalization -> DE analysis -> enrichment

如果最后差异表达结果看起来很奇怪，问题可能不只在统计模型，也可能出在：

样本分组设计；
质控不足；
注释版本不匹配；
多重比对 read 的处理方式。

与真实工具或流程的连接

RNA-seq workflow from reads and QC through alignment or pseudo-alignment, quantification, normalization, and differential expression — RNA-seq 分析主线：从 reads 与质控，到 mapping / pseudo-alignment，再到定量、归一化与差异表达。

真正上手时，流程中的关键选择常常不是”用哪个工具更流行”，而是：

当前问题是否需要精确定位还是快速定量；
结果是 gene-level 还是 transcript-level；
是否存在明显批次效应；
参考和注释版本是否完全匹配。