DNA-seq 变异过滤与质量控制

快速概览

这页讨论的是 variant calling 之后的那一步：在一堆候选位点里区分出更可信的变异，而不是简单把 caller 输出的所有记录都当成'真变异'。

理解 QUAL、DP、AF、FILTER 等 VCF 字段的大致含义，比死记具体软件参数更重要。
过滤逻辑高度依赖 caller、样本类型和设计，下面只提供通用直觉，不是固定阈值菜单。

所属板块 分析方向与案例

把基础对象与算法方法重新放回真实分析任务与工作流。

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问题定义

变异过滤（Variant Filtering）要解决的核心问题是：

输入：一个候选变异集合（通常来自 caller 的原始 VCF 输出），每个变异附带质量分数、深度、等位基因频率等统计信息。
输出：一个经过筛选的变异子集，尽可能保留真实的生物学变异，同时剔除假阳性。

该问题的本质是在召回率（Recall）与精确率（Precision）之间做权衡。过度严格的过滤会导致假阴性（漏掉真实变异），而过度宽松的过滤则会保留大量假阳性。

为什么重要

caller 产生的原始候选集通常包含大量假阳性。研究表明，未经过滤的变异调用中假阳性率可能高达 10-30%。过滤这一层连接了：

原始数据层：BAM 中的 read 证据、比对质量、碱基质量；
统计层：VCF 中的质量字段（QUAL、GQ）、深度（DP）、等位基因频率（AF）；
算法层：caller 内部的统计模型和过滤逻辑；
上下文层：重复区域、低复杂度区域、样本类型（germline vs somatic）。

如果过滤策略不合理，后续解释、数据库查询和统计分析都会建立在不稳定的候选集上，导致研究结论不可靠。

核心概念

常用 VCF 字段的统计意义

理解以下字段的统计含义是设计过滤策略的基础：

QUAL (Quality Score): 变异位点的整体质量估计，通常为 Phred 标度：$QUAL = -10 log_{10} P( ext{变异不存在} | ext{数据})$。注意不同 caller 的计算方法可能有差异。
DP (Depth / Read Depth): 该位点的测序深度，即覆盖该位置的 reads 数量。深度过低（如 $< 10$）难以提供稳定证据；深度过高（如 $> 500$）可能提示重复区域或技术偏好。
AF (Allele Frequency) / VAF: 支持替代等位基因的 reads 占总 reads 的比例。对于二倍体 germline 数据，理想杂合位点 $AF approx 0.5$，纯合位点 $AF approx 1.0$；somatic 变异中 $AF$ 反映克隆频率。
FILTER: caller 或过滤工具赋予的状态标记。PASS 表示通过所有内部过滤；其他标记（如 LowQual、StrandBias、ClusteredEvents）提示特定的可疑特征。
GQ (Genotype Quality): 基因型判定的质量分数，$GQ = -10 log_{10} P( ext{错误基因型} | ext{数据})$。高 GQ 表示对 0/0、0/1、1/1 的判断有信心。
SB (Strand Bias): 链偏好性度量。真实变异应在正负链上都有支持 reads；若变异只出现在单链，可能是测序错误或链特异性偏好。

过滤策略的分类

1. Hard Filtering（硬过滤）

定义：基于单个或多个字段的简单阈值进行二元判定。

$\text{Keep}(v) = \begin{cases} \text{True} & \text{if } DP(v) \geq DP_{\min} \land QUAL(v) \geq QUAL_{\min} \land \dots \\ \text{False} & \text{otherwise} \end{cases}$

优点：

直观可解释，易于实现和调试；
计算成本低，适合大规模数据。

缺点：

难以自适应不同平台（Illumina vs. PacBio）和实验条件；
阈值选择往往基于经验，缺乏统计严谨性；
无法捕捉字段间的复杂交互。

2. 模型化过滤（Soft Filtering / ML-based）

定义：使用统计模型或机器学习方法，基于多个特征联合评估变异可信度。

常见方法：

高斯混合模型（GMM）：将变异特征分布建模为真假阳性的混合；
随机森林 / 神经网络：利用标注数据训练分类器；
Variant Quality Score Recalibration (VQSR)：用已知变异位点训练模型，为每个变异分配校准后的质量分数。

优点：

能整合多个证据源；
可学习平台特定的错误模式；
输出连续的质量分数，便于下游阈值调整。

缺点：

需要高质量的训练数据；
模型假设可能不适用于所有样本类型；
跨项目迁移时需要重新评估。

区域上下文

即使字段看起来不错，在重复序列和低复杂度区域仍可能出现：

多重比对导致定位不稳定；
mapping 错位导致假阳性 indel 或 SNP；
coverage 异常堆积掩盖真实模式。

示例

在教学或探索阶段，可以先用一个较为保守的思路：

看 FILTER = PASS；
看深度是否过低；
看等位基因支持是否只来自极少数低质量 reads；
对重复和低复杂度区域额外谨慎。

需要强调的是：不存在一组对所有数据都正确的通用阈值。

过滤策略必须结合：

测序平台与实验设计；
caller 的具体字段定义；
下游任务对假阳性和假阴性的容忍度。

与真实工具或流程的连接

真正的 variant filtering 不是看单个字段，而是把以下证据一起看：

BAM 中的 read 支持；
VCF 中的质量和偏好性指标；
caller 文档中的 FILTER 含义；
区域注释、群体频率与功能注释。

因此，它是连接 caller 输出与结果解释的一层关键桥梁。