TPM、FPKM、CPM 与有效长度

快速概览

RNA-seq 表达量归一化是消除测序深度和基因长度偏差、实现跨样本可比性的关键步骤。本节对比 CPM、FPKM、TPM 的归一化逻辑，并引入有效长度的概念。

• 掌握 counts 到 CPM/FPKM/TPM 的公式转换与数学本质
• 理解为什么 TPM 在跨样本比较中具有更好的统计性质
• 掌握有效长度（Effective Length） 的定义及其对定量的修正作用
• 辨析归一化数据与原始计数在差异表达分析中的不同角色

前置知识

• 测序 Reads 与覆盖度
• RNA-seq 工作流

所属板块 分析方向与案例

把基础对象与算法方法重新放回真实分析任务与工作流。

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1. 是什么

CPM、FPKM 和 TPM 是 RNA-seq 数据中最常用的三种表达量归一化指标。它们的作用是将原始 Read 计数（Raw Counts）转化为可以跨样本、跨基因进行比较的标准化数值。

这三者的核心目标是一致的：消除测序深度（Sequencing Depth）和基因/转录本长度（Gene/Transcript Length）对计数造成的系统性偏差。但它们在归一化的顺序和数学性质上存在关键差异，导致适用场景不同。

2. 要解决什么生物信息学问题

原始计数（Raw Counts）受到两个主要系统偏差的影响，如果不加校正就直接比较，会得出错误的结论：

1. 测序深度偏差：假设样本 A 测了 3000 万 Reads，样本 B 测了 5000 万 Reads，那么同一个基因在样本 B 中的 Counts 天然就会偏高。如果直接比较 Counts，差异会反映测序量而非真实表达水平。
2. 基因长度偏差：假设基因 X 长度为 2000 bp，基因 Y 长度为 500 bp，在相同的转录本数量下，基因 X 会产生约 4 倍于基因 Y 的 Reads。如果直接比较 Counts，长基因会系统性地显得”表达量更高”。

归一化的任务就是设计一个数学变换，使得变换后的数值尽可能反映转录本的真实分子数量或转录本在总 RNA 池中的相对比例。

3. 输入与输出

输入

• 原始计数矩阵：行代表基因/转录本，列代表样本，值为落在该基因/转录本上的 Reads 数量。
• 基因/转录本长度信息：通常为有效长度（Effective Length），由定量工具（如 Salmon、Kallisto）估计。
• 可选：GC 含量、文库组成偏差等额外校正因子（如 DESeq2 的 size factors）。

输出

• CPM 矩阵：仅校正测序深度的归一化值。
• FPKM/RPKM 矩阵：同时校正测序深度和基因长度的归一化值。
• TPM 矩阵：现代推荐的同时校正深度和长度的归一化值，具有更好的跨样本可比性。

4. 核心思想与数学模型

4.1 CPM (Counts Per Million)

CPM 是最简单的归一化方法，仅校正测序深度：

$\text{CPM}_i = \frac{c_i}{\sum_{j=1}^{N} c_j} \times 10^6$

其中 $c_i$ 是基因 $i$ 的原始计数，$\sum_{j=1}^{N} c_j$ 是样本的总 Reads 数（文库大小, Library Size），$N$ 是基因总数。

• 优点：计算简单，直觉清晰。适用于同一个样本内不同基因之间的粗略比较。
• 缺点：没有校正基因长度，因此不能直接比较不同基因的表达量。例如，一个 CPM 为 100 的短基因和一个 CPM 为 100 的长基因，其真实转录本分子数可能相差数倍。

4.2 RPKM / FPKM

RPKM (Reads Per Kilobase per Million) 用于单端测序，FPKM (Fragments Per Kilobase per Million) 用于双端测序。两者的数学结构相同：

$\text{FPKM}_i = \frac{c_i}{\tilde{L}_i / 10^3 \times \sum_{j=1}^{N} c_j / 10^6} = \frac{c_i \times 10^9}{\tilde{L}_i \times \sum_{j=1}^{N} c_j}$

其中 $\tilde{L}_i$ 是基因 $i$ 的有效长度（单位为 bp），$c_i$ 是原始计数。

FPKM 的归一化逻辑是”先按长度校正，再按深度校正”：

1. 长度校正：将计数除以基因长度（以 kb 为单位），得到”每 kb 的 Read 密度”。
2. 深度校正：再除以总 Reads 数（以百万为单位），得到”每百万 Reads 中每 kb 的 Read 数”。

RPKM (Reads Per Kilobase per Million)

单端测序时代的标准归一化指标。公式：$RPKM = rac{Reads imes 10^9}{Length imes TotalReads}$。由 Mortazavi 等人在 2008 年提出。

FPKM (Fragments Per Kilobase per Million)

双端测序时代的对应指标。区别在于计数单位从"Reads"变为"Fragments"（一个 Fragment 可能对应一对 Reads）。公式结构与 RPKM 相同。

TPM (Transcripts Per Million)

现代推荐的归一化指标。核心改进：确保每个样本中所有基因的 TPM 总和恰好等于 $10^6$，使跨样本比较的比例关系更加一致。

4.3 TPM (Transcripts Per Million)

TPM 的计算分为两步：

第一步：按长度归一化（计算 RPK）

$\text{RPK}_i = \frac{c_i}{\tilde{L}_i / 10^3}$

第二步：按深度归一化（缩放到 $10^6$）

$\text{TPM}_i = \frac{\text{RPK}_i}{\sum_{j=1}^{N} \text{RPK}_j} \times 10^6$

TPM 的关键性质：在任何样本中，$\sum_{i=1}^{N} \text{TPM}_i = 10^6$。

4.4 为什么 TPM 优于 FPKM？

两者的差异在于归一化的顺序：

	FPKM	TPM
第一步	除以长度	除以长度
第二步	除以总 Reads 数（一个固定的标量）	除以所有基因 RPK 之和（一个与基因表达分布相关的量）

FPKM 的缺陷：不同样本的 FPKM 总和是不固定的。如果样本 A 中少数高表达基因占据了大量 Reads（即”文库组成偏差”），那么样本 A 的 FPKM 总和会不同于样本 B。这导致 FPKM 的比例关系在跨样本比较时会发生扭曲。

TPM 的优势：由于 TPM 总和恒为 $10^6$，TPM 直接反映了转录本池中的相对比例。如果基因 X 在样本 A 中的 TPM 是 50，在样本 B 中是 100，那么可以直接说基因 X 在样本 B 中的相对丰度是样本 A 的 2 倍。这种比例关系的保真性是 FPKM 无法保证的。

4.5 FPKM 与 TPM 的数学关系

从 FPKM 转换到 TPM：

$\text{TPM}_i = \frac{\text{FPKM}_i}{\sum_{j=1}^{N} \text{FPKM}_j} \times 10^6$

这个公式揭示了 TPM 的本质：对 FPKM 做了一次”再归一化”，使得所有基因的值加起来等于 $10^6$。因此，TPM 和 FPKM 之间的相对关系在同一样本内是相同的——基因 X 的 TPM 是基因 Y 的 3 倍，那么基因 X 的 FPKM 也是基因 Y 的 3 倍。差异仅体现在跨样本比较时。

4.6 有效长度（Effective Length）

在上述公式中，长度 $L_i$ 并非转录本的名义长度（Nominal Length），而是有效长度（Effective Length） $\tilde{L}_i$。

为什么需要有效长度？

理想状态下，Read 可以落在转录本的任何位置。但现实中，受 Read 长度和文库构建的限制：

• 转录本的 5’ 端和 3’ 端附近无法产生完整的 Read（因为 Read 长度可能超出边界）。
• 文库构建过程中的片段化（Fragmentation）步骤会引入偏好性（如超声波打断的片段长度分布并非均匀）。

因此，能够有效产生 Reads 的区域短于转录本的全长。

有效长度的定义

$\tilde{L}_i = L_i - \mu_{\text{frag}} + 1$

其中 $L_i$ 是转录本 $i$ 的名义长度，$\mu_{\text{frag}}$ 是文库中片段（Fragment）的平均长度。减去 $\mu_{\text{frag}} - 1$ 是因为：如果片段的平均长度为 $l$，那么转录本的前 $l-1$ 个碱基和后 $l-1$ 个碱基无法产生完整的片段。

实际估计

Salmon 和 Kallisto 等现代工具并非使用固定的片段平均长度，而是通过期望最大化（EM）算法从数据中动态估计每个转录本的有效长度。这种方法能够捕捉不同转录本之间的片段化偏好差异，提供更精确的定量结果。

5. Worked Example

场景

假设一个样本中有 3 个基因，测序总 Reads 数为 $10^7$（1000 万），片段平均长度为 200 bp。

基因	原始计数 $c_i$	名义长度 $L_i$ (bp)	有效长度 $\tilde{L}_i$ (bp)
Gene A	50,000	2,000	1,801
Gene B	10,000	1,000	801
Gene C	1,000	500	301

计算 CPM

$\text{CPM}_A = \frac{50000}{10000000} \times 10^6 = 5000$ $\text{CPM}_B = \frac{10000}{10000000} \times 10^6 = 1000$ $\text{CPM}_C = \frac{1000}{10000000} \times 10^6 = 100$

注意：Gene A 的 CPM 是 Gene B 的 5 倍，但这部分反映了 Gene A 长度是 Gene B 的 2 倍。

计算 FPKM

$\text{FPKM}_A = \frac{50000 \times 10^9}{1801 \times 10^7} \approx 2776.2$ $\text{FPKM}_B = \frac{10000 \times 10^9}{801 \times 10^7} \approx 1248.4$ $\text{FPKM}_C = \frac{1000 \times 10^9}{301 \times 10^7} \approx 332.2$

FPKM 总和：$2776.2 + 1248.4 + 332.2 = 4356.8$（不等于任何固定值）。

计算 TPM

第一步：RPK

$\text{RPK}_A = \frac{50000}{1.801} \approx 27762.4$ $\text{RPK}_B = \frac{10000}{0.801} \approx 12484.4$ $\text{RPK}_C = \frac{1000}{0.301} \approx 3322.3$

RPK 总和：$27762.4 + 12484.4 + 3322.3 = 43569.1$

第二步：TPM

$\text{TPM}_A = \frac{27762.4}{43569.1} \times 10^6 \approx 637209$ $\text{TPM}_B = \frac{12484.4}{43569.1} \times 10^6 \approx 286524$ $\text{TPM}_C = \frac{3322.3}{43569.1} \times 10^6 \approx 76267$

TPM 总和验证：$637209 + 286524 + 76267 = 1000000$。

解读

• 校正长度后，Gene A 与 Gene B 的表达量比例从 CPM 的 5:1 变为 TPM 的约 2.2:1，反映了 Gene A 比 Gene B 长约 2 倍的效应被消除。
• TPM 可以直接用于跨样本比较：如果另一个样本中 Gene A 的 TPM 为 1274418，则可以直接推断该样本中 Gene A 的相对丰度约为本样本的 2 倍。

6. 复杂度与适用前提

CPM vs FPKM vs TPM 对比

维度	CPM（每百万计数）	TPM（每百万转录本）
归一化维度	仅校正测序深度	同时校正测序深度和基因长度
跨样本可比性	有限——受基因长度分布影响	好——总量恒为 $10^6$
适用场景	同一样本内基因间比较；差异表达原始输入	跨样本基因表达比较
统计性质	保持原始计数的离散分布	归一化比例值，丢失方差信息
DESeq2/edgeR 兼容	推荐——使用原始计数	不推荐——统计模型假设被破坏

计算复杂度

所有三种归一化方法的时间复杂度均为 $O(N)$（$N$ 为基因/转录本数量），计算开销可忽略不计。真正的计算瓶颈在于上游的 Reads 比对或伪比对步骤。

适用前提

前提	影响程度	说明
文库大小估计准确	高	CPM/FPKM/TPM 都依赖总 Reads 数。如果文库中含有大量 rRNA 污染，总 Reads 数被高估，所有归一化值会被系统性低估。
有效长度估计合理	中-高	对于短转录本（< 500 bp），有效长度与名义长度的差异可能超过 30%，严重影响定量准确性。
RNA 组成相对均一	中	TPM 假设”大多数基因不发生变化”。如果实验条件导致全局转录组重编程（如大量基因被沉默，少数基因被极度激活），TPM 的跨样本可比性也会受到影响。
无 3’ 偏好	中	某些 RNA-seq 文库构建方案（如带有 oligo-dT 引物的方案）会引入 3’ 端偏好，导致转录本 5’ 端的覆盖度远低于 3’ 端，此时有效长度的均匀假设不再成立。

7. 与真实工具的连接

工具	输出格式	说明
Salmon	TPM + 有效计数	使用基于 EM 的在线学习算法，输出 TPM 和 NumReads（有效计数）。推荐使用 --gcBias 和 --seqBias 选项校正 GC 含量和序列偏好。
Kallisto	TPM + 估计计数	基于 k-mer 伪比对和 EM 算法，速度极快。输出 TPM 和 estimated counts。
RSEM	FPKM + TPM + 预期计数	支持 alignment-based 和 alignment-free 模式，输出多种归一化指标。
featureCounts / HTSeq-count	原始计数	仅输出基因级别的原始计数，不进行长度归一化。需要下游工具（如 tximport）进一步处理。
Cufflinks	FPKM	早期工具，输出 FPKM。已基本被 Salmon/Kallisto + tximport 工作流取代。

推荐工作流

现代 RNA-seq 定量的推荐工作流为：

$\text{Salmon/Kallisto（转录本级定量）} \xrightarrow{\text{tximport}} \text{DESeq2（差异分析）}$

其中 tximport 负责将转录本级的 TPM 和有效计数聚合为基因级的长度校正计数，DESeq2 使用原始计数性质的数据进行统计建模。TPM 仅用于可视化和样本间趋势比较。

常见误区

• 用 TPM/FPKM 做差异表达分析：
• DESeq2、edgeR、limma-voom 等差异表达分析工具的统计模型（如负二项分布）依赖于原始计数的离散性质。TPM 和 FPKM 是经过归一化的比例值，丢失了原始计数中的方差信息（如测序深度信息被"烧掉"了），直接用于这些工具会导致：
• 统计检验的 P-value 不准确。
• 检验的自由度被错误估计。
• 多重检验校正的基础失效。
• 正确做法：使用 tximport 生成的长度校正计数（Length-Adjusted Counts）或原始计数输入 DESeq2。

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